Метод серийных разведений (часть 2)
4-12-2013, 21:38
Полученную суспензию разливают в пробирки по одной капле. Однако в тех случаях, когда приходится сравнивать результаты испытания антибиотической активности веществ, в опытах, проведенных на протяжении определенного срока времени, готовят микробную суспензию с точным содержанием клеток в 1 мл среды. Для этой цели суспензию готовят по определенному стандарту, для фитопатогенных бактерий, например, по стандарту с содержанием 500 000 000 клеток в 1 мл; затем ее разводят вдвое стерильной водой. Количество клеток уменьшается при этом до 250 000 000 в 1 мл. Последнюю суспензию разливают по 0,1 мл в каждую пробирку с питательным бульоном, содержащим 2,5 мл среды. Таким образом, в каждом миллилитре будет 10 000 000 клеток.
Если в качестве тест-организмов используют споровые культуры, например Вас. subtilis или Вас. mycoides, то эти бактерии выращивают в течение 2—7 дней при 37° на твердой питательной среде в матрацах. Споры смывают стерильной дистиллированной водой и прогревают при 65° в течение 30 минут, чтобы убить вегетативные клетки, затем промывают 3 раза стерильной дистиллированной водой при центрифугировании, снова прогревают при 65° в течение 30 минут и суспензируют в стерильной дистиллированной воде. После этого определенное (по мутномеру) количество спор вносят в пробирки. Через 18—20 часов инкубации в термостате наблюдают, при каком максимальном разведении антибиотика отсутствует рост микроба: это разведение и означает титр испытуемого антибиотического вещества.
За единицу активного вещества принимают такое его минимальное количество, которое, находясь в 1 мл питательного раствора, подавляет развитие бактерий. При определении количества единиц известного уже антибиотика, например стрептомицина, пенициллина, титрование необходимо проводить параллельно с титрованием стандартного раствора данного антибиотика, служащего контролем.
Метод серийных разведений на жидкой питательной среде имеет ряд недостатков, как например: трудоемкость процесса разведения с соблюдением большой стерильности, появление устойчивых форм под воздействием небольших концентраций антибиотика, которое может затруднять подсчет истинного титра испытуемого антибиотического вещества.
Метод серийных разведений, несмотря на свою громоздкость и необходимость соблюдения строгой стерильности, широко применяется в практике для определения антибиотической активности различных веществ. Однако при этом рекомендуется соблюдение нескольких основных условий, а именно: 1) питательная среда должна быть оптимальной для развития тест-организма и иметь постоянный состав, так как даже малейшие изменения в ее составе вызывают изменения показателей антибактериального действия; 2) инкубация должна происходить при оптимальной для тест-объекта и постоянной температуре в течение постоянного и определенного времени; 3) тест-организмы должны выращиваться на среде постоянного состава и использоваться в одном и том же возрасте.
При соблюдении всех необходимых правил точность определения количества единиц активного вещества будет тем выше, чем в меньшее число раз будет отличаться разведение одной пробирки от другой в ряде разведений. Испытания необходимо проводить в трехкратной повторности.
Если в качестве тест-организмов используют споровые культуры, например Вас. subtilis или Вас. mycoides, то эти бактерии выращивают в течение 2—7 дней при 37° на твердой питательной среде в матрацах. Споры смывают стерильной дистиллированной водой и прогревают при 65° в течение 30 минут, чтобы убить вегетативные клетки, затем промывают 3 раза стерильной дистиллированной водой при центрифугировании, снова прогревают при 65° в течение 30 минут и суспензируют в стерильной дистиллированной воде. После этого определенное (по мутномеру) количество спор вносят в пробирки. Через 18—20 часов инкубации в термостате наблюдают, при каком максимальном разведении антибиотика отсутствует рост микроба: это разведение и означает титр испытуемого антибиотического вещества.
За единицу активного вещества принимают такое его минимальное количество, которое, находясь в 1 мл питательного раствора, подавляет развитие бактерий. При определении количества единиц известного уже антибиотика, например стрептомицина, пенициллина, титрование необходимо проводить параллельно с титрованием стандартного раствора данного антибиотика, служащего контролем.
Метод серийных разведений на жидкой питательной среде имеет ряд недостатков, как например: трудоемкость процесса разведения с соблюдением большой стерильности, появление устойчивых форм под воздействием небольших концентраций антибиотика, которое может затруднять подсчет истинного титра испытуемого антибиотического вещества.
Метод серийных разведений, несмотря на свою громоздкость и необходимость соблюдения строгой стерильности, широко применяется в практике для определения антибиотической активности различных веществ. Однако при этом рекомендуется соблюдение нескольких основных условий, а именно: 1) питательная среда должна быть оптимальной для развития тест-организма и иметь постоянный состав, так как даже малейшие изменения в ее составе вызывают изменения показателей антибактериального действия; 2) инкубация должна происходить при оптимальной для тест-объекта и постоянной температуре в течение постоянного и определенного времени; 3) тест-организмы должны выращиваться на среде постоянного состава и использоваться в одном и том же возрасте.
При соблюдении всех необходимых правил точность определения количества единиц активного вещества будет тем выше, чем в меньшее число раз будет отличаться разведение одной пробирки от другой в ряде разведений. Испытания необходимо проводить в трехкратной повторности.